Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2033 (2023) Citer cet article
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L’oxydation du thiosulfate par les microbes a un impact majeur sur le cycle global du soufre. Nous apportons ici la preuve que les bactéries appartenant à diverses lignées de Roseobacter sont importantes pour l’oxydation du thiosulfate dans les biofilms marins. Nous isolons et séquençons les génomes de 54 souches de Roseobacter associées au biofilm, trouvant des groupes de gènes sox conservés pour l'oxydation du thiosulfate et des plasmides, indiquant un mode de vie spécifique à une niche. L'analyse des données métagénomiques océaniques mondiales suggère que les souches de Roseobacter sont abondantes dans les biofilms et les tapis sur divers substrats, notamment les pierres, les surfaces artificielles, les racines des plantes et les cheminées de ventilation hydrothermales. L'analyse métatranscriptomique indique que la majorité des gènes sox actifs dans les biofilms appartiennent à des souches de Roseobacter. De plus, nous montrons que les souches de Roseobacter peuvent croître et oxyder le thiosulfate en sulfate dans des conditions aérobies et anaérobies. Les analyses transcriptomiques et protéomiques membranaires des biofilms formés par une souche représentative indiquent que le thiosulfate induit l'expression du gène sox et des modifications de la composition protéique de la membrane cellulaire, et favorise la formation de biofilms et la respiration anaérobie. Nous proposons que les bactéries du groupe Roseobacter soient des oxydants majeurs du thiosulfate dans les biofilms marins, où le métabolisme anaérobie du thiosulfate est préféré.
Le cycle des composés inorganiques soufrés par les microbes constitue un progrès biogéochimique important. La transformation du soufre implique le thiosulfate comme intermédiaire, abondant dans les milieux marins1,2. Il est bien connu que les bactéries oxydant le soufre comprennent diverses bactéries autotrophes appartenant à divers groupes, tels que SUP05, SAR324, BS-GSO2 et Chlorobi3. Ces bactéries utilisent la voie multi-enzymatique sox pour l'oxydation du thiosulfate4,5 et peuvent se développer de manière autotrophe en utilisant le thiosulfate comme donneur d'électrons pour la production d'énergie6. Les produits finaux de l'oxydation du thiosulfate diffèrent entre les différentes bactéries, car certaines bactéries organotrophes obligatoires (par exemple, Pseudomonas stutzeri et Catenocossus thiosyclus) oxydent incomplètement le thiosulfate en tétrathionate, tandis que d'autres hétérotrophes (par exemple, Bosea thiooxidans et Limnobacter thiooxidans) oxydent le thiosulfate en sulfate, le forme de soufre la plus oxydée, dans une voie similaire courante chez les bactéries autotrophes oxydant le soufre7. Découvert pour la première fois chez la bactérie lithoautotrophe Paracoccus pantotrophus5,8, le système enzymatique oxydant le soufre (SOX), un système multi-enzymatique périplasmique typique, est le médiateur le plus connu de l'oxydation du thiosulfate. En ce qui concerne l’utilisation des accepteurs d’électrons et la répartition des niches, des oxydants aérobies au thiosulfate ont été isolés du maximum de chlorophylle profonde9, de l’eau de mer côtière10 et des sédiments marins côtiers11, tandis que des oxydants anaérobies au thiosulfate ont été récemment signalés dans les bassins marins anoxiques12, les zones océaniques minimales d’oxygène13 et les évents hydrothermaux14. De plus, les conditions environnementales affectent les principaux produits issus de la production de thiosulfate. Par exemple, dans les sédiments marins côtiers, le thiosulfate est oxydé en proportions variables de tétrathionate et de sulfate, ainsi qu'en soufre élémentaire, en fonction des conditions sulfuriques et oxygénées11.
En tant que niche importante pour de nombreux microbes, les biofilms constituent 40 % de la biomasse microbienne océanique15. De nombreux microbes forment des biofilms lorsqu’ils commencent à s’attacher à toute surface immergée dans l’eau, comme les matériaux artificiels, les surfaces rocheuses, les peaux d’animaux et la neige marine15,16. Une communauté de biofilm marin peut être composée de centaines d’espèces microbiennes et, structurellement, le biofilm est caractérisé par une hétérogénéité en termes de concentration stratifiée en oxygène, de nutriments et de molécules de signalisation17. Nos études récentes18,19 suggèrent que les biofilms marins constituent une banque de taxons et de fonctions inconnus, contenant plus de 7 000 espèces bactériennes que l’on ne trouverait pas autrement dans le microbiote de l’eau de mer. De plus, les biofilms marins seraient impliqués dans d’importants processus biogéochimiques, tels que la conversion de la matière organique dissoute, la reminéralisation des particules et le passage des nutriments des eaux de surface vers les océans profonds20. Cependant, probablement en raison de structures de communautés physiques et de compositions taxonomiques complexes, l’oxydation du thiosulfate dans les biofilms marins reste largement inconnue, notamment en ce qui concerne les contributions des différents taxons et leurs caractéristiques métaboliques pertinentes. Des questions spécifiques sont de savoir quelles bactéries contribuent le plus à l’oxydation du thiosulfate dans les biofilms marins et comment elles conduisent ce processus.
89% identity in the 16 S rRNA gene, are heterotrophs found worldwide in marine ecosystems. The so far discovered Roseobacter group comprises 327 species and 128 genera21, represented by Ruegeria (e.g, Ruegeria pomeroyi DSS-322, a model strain), Phaeobacter (well-known strains for the production of tropodithietic acid23), Sulfitobacter (widely-distributed strains in the global ocean24), and Loktanella (adapted to the polar regions25). Certain Roseobacter strains are reported to be associated with biofilms on surfaces of marine algae, invertebrates, and particles, although most of the isolated Roseobacter strains are free-living. For instance, analyses of the Tara ocean data suggested that Ruegeria mobilis strains occur in 40 and 6% of samples of the particle-associated fraction and the free-living fraction, respectively26, implying their preference for a biofilm-associated lifestyle. Physiologically, Roseobacter strains are often known for their metabolic versatility, mainly involving carbon monoxide oxidation, aromatic compound degradation, secondary metabolic production, and oxidation of sulfur compounds27,28,29. The genomes of several isolated Roseobacter strains contain sox genes, although their ability to oxidize thiosulfate has not been experimentally demonstrated. Moreover, as thiosulfate oxidation is affected by the availability of electron acceptors, it is possible that the oxygen gradient in biofilms may promote the development of novel thiosulfate-oxidizing bacteria./p>0.1 mM) in the cultures was observed for the six strains (M382, M583, M619, S051, S190, and S2214) possessing the sox genes by barium precipitation after removing bacterial cells from the cultures, and sulfate production was detected (Supplementary Fig. 19). In particular, the sulfate production rate of Rhodobacteraceae sp. M382 is shown (Fig. 4a). This strain was selected as a model for the following analyses and experiments, because it probably represents a new genus and its genetic manipulation can be achieved. In both conditions, the sulfate concentration in M382 cultures increased along with the bacterial growth (Fig. 4a, b). In contrast, the sulfate concentrations in the cultures of two mutant strains of M382, M382-ΔsoxX, and M382-ΔsoxA, showed a slight decrease (Fig. 4a, b), confirming the role of sox genes in thiosulfate oxidation and sulfate production. The slight decrease in sulfate concentration may be due to assimilatory consumption of sulfate originally present in seawater. To confirm the production of barium sulfate, the pellet of a tested sample was examined by scanning electron microscopy (SEM) (Fig. 4c), and the dominant spectra of barium, sulfur, and oxygen were observed (Fig. 4d). These results suggested that the biofilm Roseobacter strains use sox genes for thiosulfate oxidation under both aerobic and anaerobic conditions. These results also showed that when grown planktonically, mutation of the soxX or soxA genes did not affect the growth of M382 (Fig. 4a, b), and motivated us to examine the growth of wild-type M382, M382-ΔsoxX, and M382-ΔsoxA in the biofilm state. After culture under aerobic or anaerobic conditions in artificial seawater media with 10 mM thiosulfate in biofilms, the wild-type strain displayed a significantly higher cell density than the two mutants (Supplementary Fig. 20), suggesting that thiosulfate oxidation may affect the bacterial growth when they have formed biofilms rather than grown planktonically./p>2 and P value <0.05 by Student’s t test) up-regulated by thiosulfate, 58 KEGG genes were down-regulated, while 4607 KEGG genes remained unchanged (Supplementary Fig. 21). Notably, the transcription of all sox genes was induced by thiosulfate (Fig. 5a). For example, there was over 14-fold induction of soxC transcription (Fig. 5a). Moreover, several genes related to anaerobic respiration were also induced by thiosulfate, including the ferredoxin-type protein-encoding gene napH (K02574), D-lactate dehydrogenase dld (K03777), the cytochrome c biogenetic gene ccdA (K06196), and anaerobic dimethyl sulfoxide reductase dmsC (K07308) (Fig. 5b). In addition, two ORFs encoding PorD (K11069), the substrate-binding protein of the spermidine/putrescine transport system, were up-regulated by thiosulfate, as well as an ORF encoding the outer membrane protein OmpW (K07275) (Fig. 5c), which has been reported to play a role in biofilm formation44,45. As examples, PotD is a spermidine/putrescine-binding periplasmic protein, and its overexpression strongly promotes biofilm formation in Escherichia coli44, and the mutant strain ΔompW of Acinetobacter baumannii showed reduced biofilm formation45. The full list of the genes with significantly higher transcription levels in the thiosulfate culture are shown in Supplementary Fig. 22, while the down-regulated genes are shown in Supplementary Fig. 23. It is worth mentioning that transcription of the sat gene (K00958) and three cys genes (K00381 and two K00390 genes) were down-regulated by thiosulfate (Supplementary Fig. 23), suggesting the inhibitory effect of thiosulfate on sulfate reduction./p>2 and P value <0.05 (*P value <0.05; **P value <0.01; ***P value <0.001). Exact P values in a: 0.0002, 0.0005, 1.7E-05, 0.0136, 0.0031, 0.0013, 0.0225; b: 0.0011, 0.0032, 7.5E-07, 1.5E-06, 7.8E-08, 3.8E-06, 0.0001; c: 0.0067, 0.0032, 0.0039, 0.0251; d: 4.5E-05, 0.0014, 0.0173, 0.0015, 0.0006, 0.0008, 0.0183, 0.0120; e: 0.0469, 0.0353, 0.0255; f: 0.0006, 0.0001, 0.0013, 0.0002, 0.0053, 0.0075, 0.0004, 0.0048, 0.0023, 0.0112. Source data are provided as a Source data file./p>9000 bp), and Illumina sequencing was performed on the NovaSeq 6000 system to generate 2 Gb of data (read length = 150 bp). Preliminary assembly and correction were performed with SMRT Link v5.0.1 (CCS = 3, minimum accuracy >0.99), and then corrected by the Illumina data using Minimap2 (Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences). In detail, the PacBio-derived contigs were mapped with the Illumina reads, and the locations without alignment were corrected according to the contigs assembled from Illumina reads. The chromosome and plasmid sequences were distinguished based on the reads coverage and screened by BLASTn to form a complete genome. Genome annotation was performed on a local Linux platform. Ribosomal RNA genes (rRNA) and transfer RNA genes (tRNA) were predicted using the software Barrnap (https://github.com/tseemann/barrnap) and Aragorn64, respectively. ORFs were predicted using Prodigal (version 2.60)65 in a single-genome analysis model with close-end ORF prediction. For phylogenetic analysis, 31 essential marker genes (dnaG, frr, infC, nusA, pgk, pyrG, rplA, rplB, rplC, rplD, rplE, rplF, rplK, rplL, rplM, rplN, rplP, rplS, rplT, rpmA, rpoB, rpsB, rpsC, rpsE, rpsI, rpsJ, rpsK, rpsM, rpsS, smpB, and tsf) were extracted from the genomes using AMPHORA266. The protein sequences of these marker genes were aligned using MEGA (version 6.05)67 to construct a maximum-likelihood tree under the Jones–Taylor–Thornton mode. The marker genes were aligned individually and then concatenated to generate alignments for tree construction. The tree was built in MEGA67 and bootstrap values were calculated with 500 replicates. ANI was calculated using the software fastANI68 installed in a local Linux system. Two different species show <95% ANI69, and two different strains have <99% ANI70. For functional gene annotation, the protein sequences of a given genome searched with BLASTp (E-value <1e-7) against the KEGG database (2022 version). Metabolic pathways were reconstructed using the online server KEGG Mapper (https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)./p> 1 were used as the thresholds of significance. Differentially expressed genes were illustrated using volcano plots drawn in MS Excel and heatmaps drawn with Cluster 3.0 (hierarchical clustering with average linkage79) and Java TreeView80./p>2 and P value <0.05./p>
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